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高效液相色谱办法的开辟是一个繁杂的经过，但无论再繁杂，也有其规律可寻。办法开辟经过中，一个总的准则是：先找到对象化合物的峰，尔后调换峰形，再是进一步完备。
1.找到对象化合物的峰要找到对象化合物的峰，咱们该怎么开展劳动，先举一个例子，上面是剖析氟康唑氯化钠打针液的一个谱图：
谱图上的实质首要包罗：色谱柱、波长、活动相、温度、流速和进样量这几项。这象征着若是这几个色谱前提都肯定下来了就也许根本以为这个办法曾经开辟胜利，以是开辟办法时咱们也许经过一一的考察这几个色谱前提来施行。
考察色谱前提是须要经过在色谱仪长进样来施行的，这就须要咱们首先设立一个初始前提，即回复从何起头的题目。在回复好“从何起头”这个题目以前，咱们先要理解咱们的被剖析物，就像一场战役，首先要晓得本人的仇人是谁相同，咱们要理解它的物理、化学性质，尤其是化学组织式尤其关键。以是，色谱办法开辟劳动也许经过下列的环节来开展：
1）搜集材料对它的分子量、组织式，以及在水、甲醇、乙腈、四氢呋喃、正己烷和异丙醇中的消融度有一个开头的理解。对分子量的理解在抉择色谱柱的经过中是尤其紧要的，由于色谱柱填料的孔径对化合物的分别具备紧要的影响，例子如图：
由此也许看出填料孔径对分别度和峰形是有确定影响的，A的色谱柱正常合用的规模为分子量的，若是分子量太大，在填料为A孔径的柱子上分别度会对照差，由于样本分子在色谱柱上有较好的保存是由于也许加入到填料的微孔内部，与键合在表面上的C18长链互相影响，正常孔直接径须要大于分子直径的3倍以上才不会对剖析形成影响。是以正常分子量一下的化合物提议用A的柱子来剖析，分子量大于1W小于20W的用A的来剖析，分子量大于20W的就要用凝胶柱了。
组织式关于分子极性巨细的展望以及后续调换峰形时具备尤其紧要的影响，如－COOH、－NH2、－NHR、－NR2、－OH等都是极性基团，而苯环、己环、－CH＝、－CH2－CH3等都黑白极性基团，依照阅历大概对其极性做一下决断，估量一下或者在C18上（用得至多，咱们最熟识）的保存本能怎么，再联合对象化合物在上述所说的几种溶剂中的消融度处境，对办法开辟时或者用正相柱仍是反相柱来做一个简略的决断，以及办法开辟告竣后的认证有影响。
2）抉择色谱柱I）填料孔径的抉择：依照所查材料得到的化合物分子量音信来确认色谱柱填料的孔径；
II）填料键合相（键合相是指C18、C8、苯基柱等）的抉择：在没能查到做过该样本的关系材料以前，或许并不理解其极性以前，正常最佳抉择C18柱做为初始的色谱前提。由于C18柱是咱们用得至多的，也是对其色谱保存本能最理解和熟识的，在C18柱上得到的音信咱们也许展望其极性，以及为束缚碰到的题目题目下一步或者将采用的举措。
III）填料粒径、色谱柱型号的抉择：在没有尤其指明以前，最佳哄骗咱们罕用的5um、4.6×mm或mm，和前方首选C18做初始前提相同，是为了便利展望其保存本能。
3）探测器和波长的抉择当前哄骗最为广泛的是UV探测器，是以，在不理解其能否有紫外吸取的情状下，咱们先要理解其这一本能，用准则品配成适合的溶液施行紫外扫描，搜集对象化合物最大吸取波长的数据，肯定波长；
或许是在有DAD探测器的前提下进几针准则品溶液，经过DAD的三维谱图也许得到化合物最大吸取波长的关系音信。
如无紫外吸取，则需采用适合的探测器。由于探测器是咱们监测化合物能否出峰的器械，是咱们的能看到化合物的“眼睛”，也是咱们开辟办法的根本，是以尤其紧要，需用心抉择。
4）活动相的抉择活动相的抉择须要依照探测方法来肯定，这边以UV探测器为例。液相的活动相最罕用的体制有两种，一种是甲醇和水的体制，一种是乙腈和水的体制。
这两种活动相体制没有太大的不同，但仍是区其余：
首要差别在于：
a.甲醇价值比乙腈廉价良多；
b.乙腈的洗脱本事比甲醇强；
c.甲醇在紫外上的吸取停止波长在nm左右，也即是说在nm下列基线的本底会对照高，与乙腈比拟会大大消沉化合物的峰高，减弱对象化合物的探测灵活度；
乙腈的吸取停止波长在nm左右；若是肯定的波长在nm下列，则该当抉择乙腈和水做为活动相体制，若是阔别这个波长的处所，则甲醇该当是首选。
d.流速的抉择：与上述所肯定的色谱柱型号相对应的流速，4.6mm内径色谱柱选1ml/min。
e.温度的抉择：如化合物对温度没有特其余须要（如温度高了不平静等），则在办法开辟之初，尽可能哄骗室温，云云开辟出来的办法普适性会对照广一些。抬高温度不时在背面为了提升对象化合物与另外杂质的分别度时哄骗的，或许为了消沉柱压等，在进一步优化色谱前提时才去思索。
归纳以上所抉择的一些前提做为初始前提，就也许起头下一步的对象——“找到对象化合物峰”。要找到对象化合物的峰，首先就要在咱们最熟识的C18柱上头测试一下，理解化合物的保存本事和大概的极性。
详细的环节是：先用纯甲醇做活动相，看化合物能否被洗脱下来，若是被洗脱下来峰高是几多，搜集这些数据；
尔后活动相中甲醇的比例以10％的速率递减，即甲醇：水＝90：10、80：20、70：30。。。。纯水，看活动相从首先的％甲醇——％水的经过中每改变10％的比例，谱图上会多些甚么峰，峰高会不会产生改变，多出来的峰是从那边来的；
这个经过会有三种效果：
1）纯甲醇前提下没能洗脱下来，云云表明化合物的极性很弱，保存本事尤其强，该当也许思索用正相体制来做，如抉择硅胶柱；
2）纯水前提下很难出峰而纯甲醇时很快洗脱下来，这象征着咱们也许经过调换活动相的比例找到这个峰，并联合前方活动比拟例10％改变的系列数据，抉择适合的活动相。
3）纯水前提下也依然很快就出峰，这表明化合物的极性很强，此时须要联合分子的组织式来决断，有或者是哪些基团致使了样本这么快的出峰，尔后采用响应的对策，思索增加缓冲盐，调换pH，若是须要的话，以至思索增加离子对试剂。
正常带有－NH2、－NHR、－NR2等基团的光阴增加含－SO3－磺酸基的离子对试剂（如辛烷磺酸钠）以坚固保存，而带有－SO3－、－PO4－等极性基团的化合物，则需增加如四丁基溴化铵、四丁基氢氧化铵等含N＋R4的离子对试剂。
2.调换峰形请参看《峰形前拖束缚计划》和《峰形后拖束缚计划》，详见仪器社区或下列链接：
《峰形前拖束缚计划》
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