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westernblot实验步骤

郑华国 https://m.39.net/disease/a_5387140.html

(1)甲醇(2)转移缓冲液(Tris5.8g甘氨酸2.9gSDS0.37g甲醇mlV=1L)(3)一抗,二抗(4)PBST,PBS,Tween-20(5)显影液(5X):自来水(加热至50℃)ml(以下药品加到温水中)米吐尔1.55g,亚硫酸钠(无水)22.5g,碳酸钠(无水)33.75g,溴化钾20.95g,补水至ml(6)定影液:自来水(50~60℃)ml(以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者)硫代硫酸钠g,亚硫酸钠(无水)15g,冰乙酸12.6ml,硼酸7.5g,钾明矾15g(水温冷至30℃以下时再加入),加水定容至ml,室温保存

转膜用的夹子,两块海绵垫,一支滴管,两张滤纸,一张PVDF膜,转膜槽,转移电泳仪,摇床,计时器,磁力搅拌器,转子,Westernblot盒,一块SDS-PAGE胶,脱脂奶粉

将玻璃板洗净,最后用ddH2O冲洗,将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。

分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外),过滤后作为储存液避光存放于4℃,

封胶:灌入2/3的分离胶后应立即封胶,胶浓度<10%时可用0.1%的SDS封,浓度>10%时用异丁醇或异戊醇,也可以用0.1%的SDS,封胶后静置至胶凝固。

灌好浓缩胶后1h拔除梳子,注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶,随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形,可用适当粗细的针头拨正。



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