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一、实验简介
蛋白质的纯度鉴定可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法。利用SDS-PAGE电泳方法或毛细管电泳法(CE-SDS)提供了最简单、成本最低,并且在确定样品中蛋白质组分数目方面灵敏度最高的手段,因此最为常用。SDS凝胶电泳以及利用电泳测定分子质量和大小的方法。这个方法都可以单独测定样品的纯度,方法的选择取决于希望检测待测蛋白质的何种性质。
二、基本原理
聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好,有弹性,透明,化学性质稳定,对pH和温度变化小,没有吸附和电渗作用小的特点,是一种很好的电泳支持介质。
三、实验步骤
1、制胶:根据蛋白样品的大小制不同浓度的胶,蛋白分子量小就要制高浓度的胶,分子量大的蛋白就制低浓度的胶,制不同厚度的胶所需的浓缩胶和分离胶体积也不一样。
2、加样、电泳:过稍许时间等胶凝固后把蛋白marker和所需的鉴定的蛋白和标准品蛋白(如BSA)经处理后加到加样孔中,倒入电泳缓冲液接通电源开始跑胶。
3、染色、脱色:等示踪染料溴酚蓝跑至胶末端,关闭电源,去除浓缩胶后,将分离胶放入考马斯亮蓝染色液中染色40分钟,然后放入脱色液中脱色1小时,并换脱色液2-3次。
4、结果:根据Marker(或者蛋白标准品的相对迁移率制作的标准曲线)判断蛋白大小,根据有无杂带判定蛋白的纯度。根据BSA标准品条带的灰度制作标曲,并计算出目的蛋白的相应浓度。
四、样品要求
浓度大于0.5ug/ul,体积大于50ul,含盐量不超过20mM
五、项目内容
六、实验结果图
图1SDS-PAGE电泳图
图2毛细管电泳纯度